无菌接种

（一）实践目的

组织培养是一个技操作性很强的技术，需要多看多做，通过实践，掌握植物外植体表面消毒技术，茎尖切割技术及培养技术。

（二）实践用具与材料

超净工作台、18cm手术弯剪、16cm镊子、接种盘、毛刷、纱布、培养瓶。带嫩芽的枝条若干、培养基250瓶、洗衣粉1袋、2%新洁尔灭500ml、75%酒精4l、0.1%升汞1l。

（三）实践学时与场地

8学时，植物组培实验室

（四）实践内容

1、外植体的选取及预处理

⑴外植体选取

选取生长健壮、已发芽、长势较好、无病害的植物带芽的枝条作为外植体。

⑵材料预处理

取带芽的枝条，用洗衣粉适量冲洗，然后扳取或用清洁剪刀剪取带芽部位（约1cm×1cm大小），顶芽和腋芽、大芽和小芽分开。继续用洗衣粉清洗10分钟，清洗时需不停晃动。再用自来水冲洗干净，置空培养瓶备用。

2、外植体消毒

⑴蒸馏水冲洗

外植体置于已杀菌开机的超净工作台上，新洁尔灭洗液消毒双手，用无菌蒸馏水清洗外植体2-3次，需晃动。

⑵酒精消毒

75%酒精倒入装外植体的容器内，消毒外植体30-60s，时间长短视植物材料情况而定。动作一定迅速，需晃动。然后将酒精倒去。

⑶升汞消毒

1%生汞倒入装外植体的容器内，消毒外植体5-10min，时间长短视情况而定。需晃动，在最后3min静置，升汞注满容器，将已灼烧的镊子放入容器升汞内浸泡。

⑷蒸馏水清洗

用镊子将外植体取出，放入另一无菌蒸馏水瓶中清洗，反复清洗4次。

⑸茎尖的剥离

用灼烧冷却的镊子和剪刀对外植体进行处理，剥离外植体材料芽外部小叶片，露出尖端生长点和2-3片叶原基部分，将此部分剪下做培养材料。再用无菌蒸馏水清洗3-4次。

⑹接入培养基

培养基瓶放入工作台内，将剥离的材料分别用消毒过的镊子放入培养瓶内，盖上瓶盖，置培养篮内，写上培养时间、操作人及培养品名，入培养室培养。

（五）作业

写出实践报告，简述无菌接种操作程序与体会。

（六）评分标准

明确茎尖培养程序，无菌接种操作熟练无菌，酒精、升汞处理时间得当，接种成功率﹥50%。